环氧化酶-2（COX-2）抑制剂筛选试剂盒

环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试剂盒酶

产品描述：

我司研发的环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试剂盒(Cyclooxygenase 2 Inhibitor Screening Kit，也称COX-2 Inhibitor Screening Kit)是一种利用荧光检测， 简单、快速、灵敏地用于人COX-2抑制剂高通量筛选的试剂盒。

1、 环氧化酶(cyclooxygenase, COX)又称前列腺素内氧化酶合成酶(Prostaglandin-endoperoxide synthase, PTGS) ，是一种同时具有 环氧化酶和过氧化氢酶活性的双功能酶。例如， COX的环氧化酶活性可以催化花生四烯(Arachidonic Acid, AA)转化为前列腺 素G2(prostaglandin G2, PGG2)，而COX的过氧化氢酶活性又可以将前列腺素G2转化为前列腺素H2(prostaglandin H2, PGH2)。

2、有两种常见的COX，一种是组成性表达的COX- 1，另一种是诱导性表达的COX-2。哺乳动物的COX- 1与COX-2的分子量相似， 分别是70和72KDa，其氨基酸序列有65%同源， 其中酶催化活性区域的氨基酸序列几乎一致。COX- 1在很多组织中组成性表 达，在胃粘膜、肾脏等中高表达， 催化产生维持正常生理功能的前列腺素，从而参与血管舒缩、血小板聚集、胃粘膜血流、 胃黏液分泌及肾脏功能等的调节。COX-2在正常生理状态下几乎不表达或表达很少， 仅在脑、肾脏和生殖器官等中有一定 水平的组成性表达。COX-2在巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和单核细胞等发生炎症反应时， 可以被诱导表达。例如受 炎性刺激物、损伤、有丝分裂原或致癌物质等促炎介质诱导后， COX-2的表达增高，从而参与多种病理生理过程。COX-3  是COX- 1的不同剪接体，和COX- 1相比，COX-3多保留了一个内含子，在狗(dog)中该内含子的长度为93个碱基，而在人和小鼠中长度为94个碱基，因此在狗中COX-3是有酶活性的，而人和小鼠中的COX-3由于移码突变而没有酶活性。

3、COX-2与炎症和肿瘤等的发生发展密切相关。因此， COX-2的选择性抑制剂成为药物研究的一个热点。 1991年1月第一个真 正意义上的COX-2 选择性抑制剂塞来昔布(Celecoxib) 经美国FDA 批准上市， 同年5 月第二个选择性抑制剂罗非昔布 (Rofecoxib)也在欧洲上市。这些COX-2抑制剂药物成功上市， 为后续COX-2选择性抑制剂的研究和发展开辟了广阔道路。如 今在临床上COX-2选择性抑制剂已经被广泛用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎、牙痛、手术后疼痛以及肿瘤等疾病。

4、本试剂盒的检测的基本原理参考图1 。在辅助因子(Cofactor)存在的情况下，COX-2使用其环氧化酶(COX)活性把花生四烯酸 (Arachidonic Acid)等底物环氧化生成PGG2等中间产物，继而COX-2使用其过氧化物酶(peroxidase)活性把PGG2等中间产物催 化生成PGH2等最终产物，同时把几乎没有荧光的COX-2探针(Probe)催化生成有强荧光的探针(Ex560/Em590)。这样通过荧光 检测就可以非常灵敏地检测COX-2的酶活性。 如果在反应中加入COX-2抑制剂(Inhibitor) ，荧光的生成就会被抑制，荧光强 度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。本反应生成的强荧光探针的最大激发波长为571nm， 最大发射波长为585nm ，推荐检测时的激发波长为560nm，发射波长为590nm。

图1.  本试剂盒筛选COX-2抑制剂的原理图。Probe*表示催化生成的强荧光探针

5、本试剂盒中提供了人重组COX-2(recombinant human COX-2, rhCOX-2)、底物(Substrate)、辅助因子(Cofactor)、阳性对照COX-2 抑制剂(Celecoxib)及可以被COX-2催化产生荧光的荧光探针(Probe)，并且对COX-2和底物的使用量进行了优化。不仅能检测 出IC50很低的抑制剂， 也能检测出IC50较高的抑制剂。

6、用于96孔板检测时， 一个包装的本试剂盒可以进行100次检测。

保存条件：

-20ºC保存， 半年有效。S0168-2 COX-2 Probe和S0168-3 COX-2 Cofactor (50X)需避光保存。

注意事项：

1、 COX-2 Probe在空气中不太稳定，开启后应尽快使用， 且在使用过程中要注意适当避光。

2、COX-2  Probe的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定， 样品中带入到最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)或者β-巯基乙醇 的浓度须低于10µM。

3、请确保样品的pH值在7-8之间，或者确保加入样品后反应体系的pH值在7-8之间， 否则会影响COX-2 Probe的稳定性和荧光值。

4、COX-2 Probe和COX-2 Assay Buffer需要完全解冻并回复至室温后再使用， 否则会影响检测结果。rhCOX-2使用时应在冰上进 行。 使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

5、COX-2  Substrate容易被氧化，请尽量避免长时间与空气接触。且在使用和储存过程中请注意保持低温，否则其稳定性可能 会受到影响。

6、待测抑制剂的溶剂可能会对检测产生干扰，如无水乙醇和70%乙醇。推荐以COX-2 Assay Buffer 、Milli-Q级纯水、 DMSO为 溶剂配制、稀释待测抑制剂，并在对照孔中添加与抑制剂等体积的溶剂以排除干扰。

7、COX-2 Cofactor 、COX-2 Substrate 、rhCOX-2等试剂的量均比较少，在使用前请先适当离心， 然后适当混匀后再使用。

8、 Substrate Buffer有腐蚀性， 操作时请小心， 并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其他物品；Celecoxib对人体有害，操 作时请小心， 并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

9、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

10、为了您的安全和健康， 请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

1、样品的准备：

取适量待测定的抑制剂，用COX-2 Assay Buffer 、Milli-Q级纯水、DMSO等适当的溶剂配制成适宜浓度的溶液，如果有必要 可以配制成适当的浓度梯度待用。 注：抑制剂的稀释和配制使用同一种溶剂通常会比较方便一些。

2、试剂盒的准备：

A、融解除rhCOX-2以外的其它所有试剂至室温，略离心使溶液沉淀至管底，再混匀备用。COX-2 Probe、COX-2 Cofactor (50X) 和COX-2 Substrate (50X)配制在DMSO中， 可37ºC水浴0.5-2min促进融解。使用完毕后宜立即-20ºC避光保存。

B、 COX-2 Cofactor工作液的配制：按照每个样品需要5微升COX-2 Cofactor工作液的比例配制适量的COX-2 Cofactor工作液。 取适量的COX-2 Cofactor (50X)，按照1:49的比例用COX-2 Assay Buffer稀释。例如4微升COX-2 Cofactor (50X)加入196微 升COX-2 Assay Buffer配制成200微升COX-2 Cofactor工作液。配制好的COX-2 Cofactor工作液可4ºC存放， 仅限当日使用。

C、COX-2工作液的配制：按照每个样品需5微升COX-2工作液的比例配制适量的COX-2工作液。取适量的rhCOX-2  (25X) ， 按照1:24的比例用COX-2  Assay  Buffer稀释。例如8微升rhCOX-2  (25X)加入192微升COX-2  Assay  Buffer配制成200微升 COX-2工作液。配制好的COX-2工作液可在冰浴上暂时保存，1小时内酶活性基本稳定。注： 所有涉及COX-2的操作应在 冰上进行。

D、COX-2 Substrate工作液的配制：按照每个样品需5微升COX-2 Substrate工作液的比例配制适量的COX-2 Substrate工作液。 取适量的COX-2 Substrate (50X)，加入等体积的Substrate Buffer ，充分涡旋混匀，该混合物再按照1:24的比例用Milli-Q级 纯水或重蒸水稀释， 充分涡旋混匀。例如20微升COX-2 Substrate (50X)加入20微升Substrate Buffer，涡旋混匀后， 再加入 960微升Milli-Q级纯水或重蒸水，再充分涡旋混匀，最终获得1毫升COX-2 Substrate工作液。配制好的COX-2 Substrate工 作液可在冰浴上暂时保存， 1小时内较为稳定。注： COX-2 Substrate工作液也可在样品检测时37ºC孵育10分钟的过程中配 制。

E、阳性抑制剂Celecoxib溶液的配制： 本试剂盒提供的阳性对照抑制剂Celecoxib浓度为100µM ，配制在DMSO中， 可以根据 需要使用与待测抑制剂一样的溶剂稀释成所需浓度或浓度梯度。通常Celecoxib的IC50约为10nM- 100nM ，使用本试剂盒 时Celecoxib的抑制效果参考图2。

3、样品检测：

A、参考下表，使用96孔黑板设置对照孔和样品孔， 并按照下表依次加入样品和各溶液。加入待测样品后， 混匀， 37ºC孵育 10分钟。

注： 加入待测样品后的孵育也可以在25ºC或室温进行。大多数的抑制剂对COX-2活性抑制具有时间依赖性，改 变与抑制剂的作用时间可以显著改变化合物的IC50值， 建议通过测试确定未知抑制剂比较适合的孵育时间。为获得更加可靠的检测结果， 建议每个样品至少应该进行2个重复孔的检测。

 注： *样品溶剂是指配制和稀释待测抑制剂所用的溶剂。

B、各孔加入COX-2 Probe 5微升。

C、各孔快速加入COX-2 Substrate工作液5微升，混匀。 注： 加入COX-2 Substrate工作液后反应即会开始， 如果孔数较多， 可以在低温操作或使用排枪操作以减小各孔间加入COX-2 Substrate工作液的时间差而导致的误差，混匀也可以在培养板振 荡器上进行。

D、37ºC避光孵育5分钟后进行荧光测定。激发波长为560nm，发射波长为590nm 。当荧光读数偏低时，也可适当延长孵育时 间至10-20分钟。

4、计算:

A、计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照 、RFU100%酶活性对照 、RFU阳性抑制剂对照和RFU样品 。RFU， Relative Fluorescence Unit。

B、计算每个样品的抑制百分率。计算公式如下：

抑制率(%) = (RFU100%酶活性对照 - RFU样品)/ (RFU100%酶活性对照 - RFU空白对照) × 100%

C、对于检测发现有效的制剂，通过检测该抑制剂的剂量效应就可以测定出该抑制剂的IC50 。本试剂盒检测Celecoxib抑制 效果的检测结果如图2所示，IC50约为30nM。