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过氧化氢酶(Catalase)试剂盒(紫外吸收法)

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    正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:                           

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用

测定原理:

H2O2240nm下有特征吸收峰,CAT能够分解H2O2,使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板UV板)、研钵、冰蒸馏水

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4保存

工作液液体24mL×1瓶,4保存

粗酶液提取

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g:提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至240nm,蒸馏水调零。

2、 测定前将CAT检测工作液37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上

3、 准备96UV板一块(非普通酶标板,普通酶标板只能透过可见光,不能透过紫外光,检测波长小于340nm务必使用UV)。

4、 在微量石英比色皿或96UV板中加入10μL样本和190μL工作液,混匀,记录240nm初始吸光值A11min后的吸光值A2。计算ΔAA1-A2

注意事项:出现负值怎么办?

首先检查吸光值是否超过3,如果超过3很可能是没有用UV板,请换用UV板。如果未超过3,仍然出现负值则检查反应过程是否产生气泡,气泡多说明酶活性太高,气泡影响产生了负值,可以将样本用提取液稀释10倍后再检测。如果稀释样本或反应体系没有产生气泡仍然出现较小的负值,说明该样本测不到该酶活。

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